Антифризы рыб

В норме кровь рыб замерзает при температуре от -0,4 С до -0,9 С. Так как подавляющее большинство видов никогда не встречаются с такими низкими температурами в природе, то и риска замерзнуть перед ними не стоит. Однако рыбы обитают и в высокоширотных Арктических и Антарктических морях, где благодаря суровому климату и высокой солености температура "жидкой" воды в некоторых районах приближается к -1,9 С. Как же эти рыбы выживают, если температура окружающей среды зачастую почти на 1С ниже температуры замерзания их крови? Все дело в том, что в их организме содержатся специальные вещества - антифризы, которые препятствуют образованию льда. Об этом и пойдет речь сегодня.

О присутствии антифризов в организме не только рыб, но и других живых существ (сейчас они обнаружены у насекомых, растений, грибов и даже бактерий) до недавнего времени ничего не было известно. История их изучения началась лишь в 1970-х годах, когда ученые задались вопросом как выживают холодноводные рыбы антарктических морей в очевидно крайне суровых и неподходящих для обитания большинства животных условиях. Первым объектом этих исследований стали нототениевые рыбы (сем. Nototheniidae) - наиболее массовые и широко распространенные обитатели антарктических вод. После того, как антифризы были обнаружены в их организме, новые уже более "прицельные" поиски подобных веществ начались и у других видов, и очень быстро стало понятно, что они имеют достаточно широкое распространение.

С каждым годом исследователи обнаруживают у рыб все новые и новые классы антифризов, но все же большинство из них (об исключениях я расскажу ниже) являются белками. Как правило, это очень крупные молекулы с высокой молекулярной массой, в составе которых можно выделить повторяющиеся последовательности ("блоки") аминокислот. На основе аминокислотного состава этих последовательностей и формы молекулы (шарообразная, спиральная и т.п.) выделяют 5 типов антифризов: 4 из них являются протеинами (antifreeze proteins - AFPs) и еще 1 гликопротеином (antifreeze glycoprotein - AFGPs). Подробнее об их строении я расскажу чуть ниже, а сейчас - о принципе их работы.

С самого момента открытия белков-антифризов многие ученые с большим скепсисом относились к утверждению об их антифризной функции. Было совершенно непонятно, каким образом они снижают температуру замерзания воды, ведь до сих пор считалось, что в живых организмах на это влияет только присутствие электролитов (главным образом солей).

Тем не менее, исследователи, обнаружившие эти белки, были уверены в своей правоте и не переставали выдвигать гипотезы и ставить эксперименты до тех пор, пока, наконец, не установили механизм их работы. Оказалось, что связан он с особенностями процесса замерзания воды.

Этот процесс, пусть и примитивно, можно описать следующим образом: при понижении температуры отдельные молекулы воды объединяются в микроскопические кристаллы льда, после чего, за счет присоединения все новых и новых молекул, эти кристаллы разрастаются до тех пор, пока все молекулы воды не окажутся связанными. Так вот молекулы белков-антифризов умеют распознавать еще только начинающие формироваться кристаллы льда и, специфически связываясь с ними, препятствовать присоединению к ним новых молекул воды, блокируя тем самым их последующий рост. Это и позволяет жидкостям в организме рыб оставаться жидкими при температурах, ниже температуры замерзания.

Интересный факт: кристаллы льда, к которым присоединились молекулы белков-антифризов, могут сохраняться даже при наступлении положительных температур, что обеспечивает их присутствие в организме рыбы чуть ли не на протяжении всей ее жизни, которая может длиться более 20 лет.

Имеющиеся на сегодняшний день данные указывают на то, что белки-антифризы работают только в межклеточных жидкостях, а не внутри клеток, которые, как считается, достаточно хорошо защищены клеточной мембраной и поэтому антифризов внутри не содержат. К межклеточным жидкостям относится, в том числе, плазма крови - важнейшей ткани, замерзание которой привело бы к блокированию ее транспортной функции и гибели животного. Именно поэтому наибольшей концентрации белки-антифризы достигают здесь. Кровь, однако, является не единственным местом присутствия антифризов, что естественно - воздействию холодных температур подвергается весь организм. Исходя из этого становится понятным обнаружение высоких концентраций антифризов в коже, жабрах и глазах рыб - эти органы первыми контактируют с холодом, создавая своеобразный фронт борьбы с ним. Кроме того, в силу постоянной необходимости заглатывать воду (это связано с особенностями осморегуляции) еще одним местом соприкосновения морских рыб с низкими температурами окружающей среды является кишечник, поэтому здесь также присутствуют антифризы.

Поначалу считалось, что белки-антифризы (речь именно о AFPs) синтезируются только в печени рыб, откуда попадают напрямую в кровь и разносятся по всему организму. Однако их повышенные концентрации в ряде органов (кожа, жабры, глаза и т.п.) и отсутствие специфических рецепторов белков-антифризов (их наличие позволило бы органу распознать белок и "забрать" его из крови) заставили ученых задуматься о том, что, возможно, в ряде случаев они синтезируются непосредственно в самих органах. И действительно, специальные исследования подтверждают это - синтез некоторых типов белков-антифризов (AFPs) происходит в глазах, клетках жабр и кожи - там, где более всего необходим быстрый ответ на появление холода.

Что касается антифризов-гликопротеинов (AFGPs), то их цикл в организме несколько сложнее: основная их масса производится в поджелудочной железе, откуда они попадают сначала в кишечник (и защищают его от замерзания) и только потом всасываются в кровь через эпителий в его задних отделах. Кроме того, часть AFGPs синтезируется специальными клетками самого желудка. Замечу также, что попадание антифризов непосредственно в пищеварительную систему приводит к тому, что часть из них неизбежно вымывается из организма рыбы вместе с фекалиями.

Несмотря на суровость полярных океанов, температура воды в них все же подвержена сезонным колебаниям и зачастую опускается ниже 0 градусов только в "зимние" месяцы. Это означает, что с проблемой выживания в гиперхолодной воде рыбы также сталкиваются не круглый год. Так вот, исследования показали, что у северных видов белки-антифризы AFPs присутствуют в организме не постоянно - они начинают вырабатываться при понижении температуры в предзимние месяцы, а максимальных концентраций достигают зимой, когда температура воды опускается до минимальных (ниже 0 градусов) значений.

Выше я уже упоминал, что антифризы, обнаруженные в организме рыб, разделяются на 5 крупных типов: 4 из них относятся к белкам (AFPs) и 1 к гликопротеинам (AFGPs).

Об их строении нужно рассказать подробнее.

Так как первыми антифризами, обнаруженными в организме рыб, были гликопротеины (AFGPs), то начну с них. Гликопротеины - это двухкомпонентные белки, в состав которых входят сахара. Не вдаваясь в подробности, скажу, что антифризы-гликопротеины рыб состоят из повторяющихся блоков из трех аминокислот - 2 аланинов и 1 треонина (-Ala-Ala-Thr-), где на каждый треонин "навешена" молекула сахара (для тех, кому интересно, это дисахарид галактозил-N-ацетилгалактозамин). Таких блоков в молекуле антифриза может быть от 4 до более чем 50, так что в итоге масса молекул колеблется от 2600 до 33000 Дальтон.

Теперь перейдем к антифризам-протеинам (AFPs). Как я уже сказал выше, их классификация построена на основе внешнего строения и аминокислотного состава молекулы. В настоящее время известны 4 типа AFPs: type-I, type-II, type-III, type-IV.

Антифризы-протеины 1-го типа (type-I AFPs), как и AFGPs, богаты аминокислотами аланин и треонин, причем в таком же соотношении 2:1, и имеют форму альфа-закрученной моноспирали. Кроме упомянутых выше аланина и треонина, в состав этого типа антифризов входят и другие аминокислоты. Их масса находится в пределах 3300-4500 Дальтон.

Антифризы-протеины 2-го типа (type-II AFPs), наоборот, богаты аминокислотой цистеин и имеют шарообразную форму. Это более крупные молекулы с массой 11000-24000 Дальтон.

Антифризы-протеины 3-го типа (type-III AFPs) имеет структуру из двух параллельных плоскостей и напоминает тем самым сэндвич (в англоязычной литературе эту форму так и называют beta-sandwich). Интересно, что среди антифризов этого типа выделяют два подтипа, один из которых не является антифризом, то есть не обладает способностью присоединяться к кристаллам льда. При этом в препятствовании кристаллизации (замерзанию) воды он все же принимает участие - будучи в смеси с первым подтипом он увеличивает активность последнего в несколько раз. Молекулярная масса этих молекул составляет около 6500 Дальтон.

В составе антифризов-протеинов 4-го типа (type-IV AFPs), также как и у AFPs type-I, преобладает аминокислота аланин, более того, в их структуре также выделяют спиральные элементы. Однако элементов этих несколько и, будучи компактно упакованы, вместе они образуют итоговую шарообразную форму молекулы, масса которой около 12000 Дальтон.

Распространение антифризов среди морских рыб как северных, так и южных полярных и приполярных вод имеет ряд интересных особенностей.

Такой сложный и неоднотипный характер распределения белков-антифризов говорит о том, что они возникли сравнительно недавно, а их эволюция происходила во многих группах независимо, но при этом достаточно резко. Ученые связывают это с последним периодом мощных полярных оледенений и приводят следующие оценки: в северном полушарии белки-антифризы появились у рыб примерно 1-2 млн лет назад, а в южном - около 10-30 млн лет.

Помимо белков-антифризов в последние два десятилетия были открыты еще несколько веществ, обладающих антифризной функцией. При этом они не всегда имеют белковую природу и могут действовать совершенно иным образом, в частности являться электролитами.

Одним из них является спирт глицерол, который был обнаружен в организме корюшки Osmerus mordax и мойвы Mallotus villosus. При этом в организме этих рыб уже присутствуют белки-антифризы, однако, так как молекулы глицерола по сравнению с молекулами белков имеют значительно меньшие размеры, они в отличие от последних могут свободно проникать в клетки и защищать их от возникновения льда, обеспечивая тем самым их дополнительную защиту.

Несмотря на то, что пресноводные рыбы почти никогда не сталкиваются с воздействием отрицательных температур, в их организме также могут присутствовать антифризы, правда обнаружены они пока только у двух видов (карася Carassius auratus и данио Danio rerio) и только одного типа (AFPs type-IV). При этом концентрация их весьма незначительна, а выполняемые функции до конца не ясны. И если для карася их антифризную функцию предположить возможно (все-таки известна его способность перезимовывать в суровых условиях замерзших водоемов), то для тропического Данио это исключено - у него их роль вероятно сводится к регуляторной.

Ну и в заключение не могу не сказать еще об одном. Открытие антифризов имеет не только важное научное значение, так как пополняет копилку наших знаний о разнообразии и особенностях функционирования живых существ, но и серьезный коммерческий потенциал. Перспективы хозяйственного использования антифризов почти безграничны и способны кардинально изменить всю нашу жизнь. Уже сейчас компании вкладывают огромные деньги в исследования возможного применения антифризов в трансплантологии (они могут позволить увеличить время сохранения органов), пищевой промышленности (как метод сохранения свежести продуктов или, например, в производстве мороженого), сельском хозяйстве (могут повысить выживаемость теплолюбивых видов в суровых условиях) и ряде других отраслей.

[1] J. G. Duman, 2015. Animal ice-binding (antifreeze) proteins and glycolipids: an overview with emphasis on physiological function // The Journal of Experimental Biology (2015) 218, 1846-1855 doi:10.1242/jeb.116905

[2] Musharaf Hossain, 2012. Fish antifreeze proteins: Computational analysis and physicochemical characterization // International Current Pharmaceutical Journal 2012, 1(2): 18-26

[3] G. L. Fletcher, C. L. Hew, P. L. Davies, 2001. Antifreeze proteins of teleost fishes. // Annu. Rev. Physiol. 2001. 63:359–90

[4] E. Kristiansen, K. E. Zachariassen, 2005. The mechanism by which fish antifreeze proteins cause thermal hysteresis // Cryobiology 51 (2005) 262–280

[5] Woon-Kai Low, Qingsong Lin, Costas Stathakis, Ming Miao, Garth L. Fletcher, Choy L. Hew, 2001. Isolation and Characterization of Skin-type, Type I Antifreeze Polypeptides from the Longhorn Sculpin, Myoxocephalus octodecemspinosus // The journal of biological chemistry. Vol. 276, No. 15, Issue of April 13, pp. 11582–11589, 2001

[6] J. A. Raymond, 1992. Glycerol Is a Colligative Antifreeze in Some Northern Fishes // The journal of experimental zoology 262:347-352 (1992)